特纳综合征女孩卵泡和基质细胞的基因表达分析

豫见生殖专栏介绍

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在嵌合型特纳综合征患者中，卵巢体细胞（颗粒细胞和基质细胞）表现出高度的非整倍性，核型为45，X，这可能会影响卵巢中的基因表达，并导致其生育能力降低。本研究的目的是研究体细胞卵巢细胞非整倍性对嵌合型（45，X/46，XX）特纳综合征患者卵巢皮质基质细胞和小卵泡基因表达的影响。为此，通过腹腔镜手术获取8名嵌合型特纳综合征患者（5-19岁）和8名对照组（6-18岁）的卵巢皮质组织。分离组织以获得纯化的卵泡和基质细胞。部分纯化组分用于通过间期FISH测定特纳综合征患者卵巢细胞的X染色体含量，而剩余部分用于将这些细胞的基因表达谱与对照组进行比较。结果表明，与对照组相比，特纳综合征患者皮质基质细胞中的高水平45，X单倍体对基因表达、卵巢大体形态或皮质组织学外观没有影响。特纳综合征患者主要由45个X颗粒细胞组成的纯化小卵泡的基因表达分析显示11个基因的表达异常。其中，与对照组相比，6个基因（CD24、TLR1、EPHA2、PLXND1、ST6GALNAC5和NOX4）表达上调，而5个基因（CRYAB、DLX1、PCYT2、TNFRSF8和CA12）下调。且这些小卵泡中过表达的基因都与卵泡发育的晚期阶段有关。这种异常基因表达对特纳综合征患者卵的影响仍有待研究，但可能会影响生育能力。

研究背景

特纳综合征（TS）是最常见的性染色体疾病之一，大约每2500名女孩中就有1名患有这种疾病。在TS中，一条X染色体缺失、部分缺失或改变，导致大量表型和生理异常，包括甲状腺疾病、心脏和肾脏畸形、听力损失和身材矮小。

研究类型

实验研究、对比研究

材料方法

数据来源：本研究使用了8名45，X/46，XX嵌合型TS患者（年龄5-19岁，平均年龄10.3±4.7岁）和8名对照组（年龄6-18岁，平均年龄11.5±4.2岁）的卵巢皮质组织ovariancortextissue(OTC)片段。组织通过腹腔镜下卵巢切除术获得，并冷冻保存以保存生育能力。该调查是“特纳综合征女孩卵巢皮质组织保存”全国性试验的一部分。

研究分组：①根据卵巢皮质中卵泡的存在，从我们全国性试验中纳入的97名TS患者中，选择了8名年龄在5-19岁（TS1-8）、淋巴细胞中具有非结构嵌合核型45，X/46，XX（/47，XXX）的患者进行本研究。在这些嵌合型TS患者（TS1-7）的7个淋巴细胞中发现了45，X和46，XX细胞系，而TS8显示了另外的47，XXX细胞系。TS患者之间的非整倍体细胞百分比差异很大。例如，在TS6中，几乎所有的淋巴细胞都有45，X核型，而在TS3中，大多数淋巴细胞显示正常的46，XX核型。②对照组OTC片段是从6-18岁，在生育能力受到威胁的癌症治疗（C1和C3–6）、化疗/放疗后（C2和C7）或作为性别确认手术的一部分（C8）之前，接受卵巢切除术以保持生育能力的个体中获得。

研究过程：使用二甲基亚砜作为冷冻保护剂的缓慢冷冻/解冻方案对对照组和TS患者的卵巢组织片段进行冷冻保存。解冻TS患者30-100mg和对照组约80mg的组织片段，并分析卵巢细胞的X染色体含量和mRNA表达。分析中排除了测序深度（表示为捕获过程中循环smMIP的数量）低于阈值的样本。基因转录水平被标准化，并以百万分片段（FPM）表示。对数转换后，进行双尾Studentt检验，以确定TS滤泡与TS基质细胞之间的差异基因表达；对照卵泡与对照基质；TS基质与对照基质、TS卵泡与对照卵泡。此外，还比较了基于非整倍体水平的组间差异基因表达：TS基质（5-9岁）与TS基质（12-19岁）。计算倍数变化，并认为P小于0.05时具有显著性。

研究结果

（1）卵巢皮质组织分离用于FISH和基因表达分析

分别分析卵巢卵泡和基质细胞中X染色体非整倍体的基因表达模式和水平。为此，我们对皮质组织进行了酶消化，以获得纯化的滤泡和无滤泡的基质细胞。TS患者和对照组的部分纯化组分用于基因表达分析。此外，还对TS患者的卵泡和基质细胞进行FISH分析，以确定X染色体非整倍体的水平。FISH和基因表达分析表明，卵泡和基质细胞的分离非常有效。

例如，在TS1的皮质组织中，30%的基质细胞是46，XX，而11个纯化卵泡的227个颗粒细胞都是45，X。这表明这些纯化卵泡没有被基质细胞污染。基因表达分析还表明基质细胞和卵泡有效分离。已知在颗粒细胞和/或卵母细胞中表达的几种基因产物，如LHX8、BIRC5和DDX4，确实存在于TS患者和对照组的卵泡中，但在同一组织片段的基质细胞中几乎检测不到。

相比之下，CD80、GHSR和SLC5A7等基因的转录本在基质细胞中很容易检测到，但在卵泡组分中只有非常低的水平。这些结果表明，OTC的酶解以及随后基质细胞和卵泡的分离产生了纯化的细胞组分，可以可靠地用于进一步分析X染色体含量和差异基因表达。

（2）卵巢皮质基质细胞基因表达分析

通过ciRNAseq分析TS患者（n=8）和对照组（n=1888）的基质细胞中736个单个基因的表达。尽管大多数TS患者的基质细胞中存在高水平的非整倍体，但在这些细胞中，TS患者和对照组之间的基因表达没有统计学上的显著差异。卵巢切除术后，不同非整倍体基质细胞百分比（TS2:34%、TS5:78%或TS6:95%）的TS患者卵巢的宏观图像显示大体形态正常。对这些卵巢皮质基质细胞的进一步组织学检查也显示，尽管45，X基质细胞的百分比差异很大，但这些组织之间没有明显差异。

鉴于TS患者基质细胞非整倍性水平的显著差异，我们比较了具有相对低水平嵌合的基质细胞（TS1、TS2、TS3和TS4）与具有高水平嵌合的基质细胞（TS5、TS6、TS7和TS8）的基因表达模式。发现与低水平嵌合的TS患者相比，高嵌合TS患者的基质细胞中的基因表达产物（包括DDX4、DHH、MYBL2、CSF1R和ERBB2）明显较低（P小于0.05）。

（3）卵泡基因表达分析

通过ciRNAseq分析TS患者和年龄匹配的对照组纯化卵泡的基因表达。该技术可以高测序深度定量检测感兴趣的mRNA，并已成功用于分析各种组织中的基因表达。在TS患者来源的卵泡和对照组卵泡中，共有11个基因的表达存在统计学上的显著差异（倍数变化大于3；α=0.05）。

其中6个基因（CD24、Toll样受体1（TLR1）、肝配蛋白受体A2（EPHA2）、丛蛋白D1（PLXND1）、ST6N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5（ST6GALNAC5）和NADPH氧化酶4（NOX4））在TS卵泡中的表达显著上调，与对照组相比，5个基因（晶体蛋白αB（CRYAB）、远端同源框1（DLX1）、磷酸胞苷基转移酶2（PCYT2）、TNF受体超家族成员8（TNFRSF8）和碳酸酐酶12（CA12））的表达下调。

TS患者和对照组的表达水平存在相当大的差异。例如，在对照组的卵泡中检测不到CD24的表达，但在两名TS患者中也检测不到；所有卵泡中都表达NOX4转录，TS患者的卵泡中NOX4的表达水平高于对照组，7例TS患者的6例卵泡中很容易检测到TLR1的表达，但对照组只有1例。

讨论

目前，许多国家正在通过卵母细胞冷冻保存或OTC来保护TS女性的生育能力。特别是在嵌合型45、X/46、XXTS患者中，卵巢储备可能足以提供一个现实的机会，储存足够的配子，以便以后能获得妊娠。

研究Xi基因缺失对体细胞、纯化小卵泡和基质细胞基因表达的影响，通过ciRNAseq对8名年轻的45、X/46、XX嵌合型TS患者和年龄匹配的对照组进行了分析。这项技术使我们能够准确地量化两组之间数百个基因的差异表达。尽管ciRNAseq不是为了分析完整的基因表达谱而设计的，但它比全转录组或RNA测序更便宜，更适合量化相关基因表达。

将8名TS患者的卵巢皮质基质细胞的基因表达谱与对照组的基质细胞进行比较，没有发现基因产物的显著差异表达。完整卵巢的大体形态和卵巢皮质的组织学证实了这一点。这些发现可能解释了为什么TS患者的某些组织不受影响或受影响较小，尽管嵌合体的水平也可能导致了TS相关表型特征和症状的严重程度的差异。TS患者间基质细胞的非整倍体水平有很大差异。

通过比较具有相对低比例的非整倍体基质细胞（TS1-TS4）和具有较高比例的非整倍体基质细胞（TS5-TS8）的TS患者的表达谱，我们发现了一些与女性生殖有关的编码蛋白的有趣基因的差异表达。其中包括生殖细胞系特异性蛋白DDX4，该蛋白通常用作生殖细胞的标志物，但也表达于血管周细胞；DHH，参与性腺发生；MYBL2，与自噬抑制和女性生育力有关；BUB1是纺锤体组装的检查点蛋白，其低水平可导致非整倍体；CSF1R，在低质量胚胎中过度表达和ERBB2，启动原始卵泡生长。尽管基质细胞低水平嵌合的TS患者年龄（5~9岁）均小于高水平嵌合的TS患者（12~19岁），但这些基因表达的差异不太可能与年龄有关，因为在对照组中，这些基因的表达均与年龄无关（结果未显示）。

嵌合型TS患者小卵泡的基因表达分析表明，与对照组相比，6个基因（CD24、TLR1、EPHA2、PLXND1、ST6GALNAC5和NOX4）上调，5个基因（CRYAB、DLX1、PCYT2、TNFRSF8和CA12）下调。下调的基因与卵泡发育没有明显的联系，对生育力的影响也不清楚。在TS卵泡中上调的基因与卵泡发生和生育能力的关系更为明显。本研究中发现的在TS患者小卵泡中上调的基因与更晚期的卵泡发生有关，甚至与排卵后黄体终末分化颗粒细胞的功能有关。

未来对TS患者卵巢细胞基因表达的研究也应侧重于年龄依赖性差异和与大量患者非整倍体水平相关的表达差异。然而为研究招募足够数量的TS患者将非常具有挑战性。

结论

我们的研究为年轻嵌合型TS患者小卵泡中的基因表达异常提供了证据。过表达的基因都指向更高级的卵泡表型。这种异常基因表达对卵巢储备的影响、TS中使用生育力保存的有效性，以及最终对TS患者生育潜力的影响仍有待研究。

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